Eleonora, figlia del vicerè di Napoli don Pedro di Toledo, nel 1539, all'età di diciassette anni, andò in sposa a Cosimo de' Medici, secondo duca di Firenze e, successivamente, primo granduca di Toscana.
Dopo il matrimonio, Cosimo spostò la sua residenza privata da palazzo Medici di via Larga, oggi via Cavour, a Palazzo Vecchio. L'edificio fu, così, ristrutturato e ingrandito da Giovan Battista del Tasso prima, e Giorgio Vasari poi, per adattarlo alle nuove esigenze del duca e della sua famiglia.
Ad Eleonora furono riservati degli appartamenti privati al secondo piano, dove fu costruita, per suo uso esclusivo, anche una piccola cappella che rappresentò, per la duchessa, profondamente religiosa e devota, un luogo intimo e prezioso dove raccogliersi in preghiera in totale riservatezza. La cappella fu decorata da Agnolo Bronzino, l'elegante e raffinato pittore di corte da lei prediletto, autore del famoso ritratto di Eleonora col figlio Giovanni, capolavoro esposto alla Galleria degli Uffizi.

Moglie devota e madre affettuosa, Cosimo scelse per lei il motto "Cum pudore laeta foecunditas" (Gioiosa è la fecondità, se abbinata alla modestia) accompagnato ad una pavoncella che protegge i suoi piccoli, per esaltarne la figura materna e, allo stesso tempo, anche la sua grande fierezza e la sua forte determinazione.

Intelligente e riservata, fu sempre attaccatissima al marito che accompagnava spesso nei suoi viaggi di lavoro, incurante dei tanti disagi. Fu una preziosa consigliera, e il suo aiuto e sostegno furono molto cari a Cosimo durante i ventitrè anni di matrimonio, interrotti bruscamente dalla prematura scomparsa della donna, morta a soli quarant'anni.

Eleonora, infatti, assieme ai figli Giovanni e Garzia, aveva seguito il marito in un viaggio in Maremma. Qui i due figli, dopo aver contratto la malaria, morirono in breve tempo. Dopo poco, però, la stessa sorte toccò anche a lei. Grande fu la costernazione di Cosimo che, dopo un paio d'anni dalla perdita dei figli e della tanto amata moglie, si ritirò dalla vita pubblica, lasciando al primogenito Francesco il governo del Granducato.