Eleonora di Toledo fu la prima moglie di Cosimo I de' Medici, secondo duca di Firenze e successivamente primo granduca di Toscana. Nel 1540, subito dopo il matrimonio, Cosimo spostò la sua residenza privata da palazzo Medici di via Larga a Palazzo Vecchio, che venne così ristrutturato e ingrandito per adattarlo alle nuove esigenze della sua famiglia.

Per i suoi appartamenti il duca scelse il primo piano, mentre il secondo fu destinato a quelli di Eleonora, dove fu costruita anche una piccola cappella. Essendo molto religiosa e devota, la cappella rappresentò per la duchessa un luogo intimo e prezioso dove trascorrere parte del suo tempo. Fu realizzata fra il 1540 e il 1545 da Giovan Battista del Tasso e decorata dal pittore Agnolo Bronzino, l'elegante e raffinato artista da lei prediletto.

Per gli affreschi, che ricoprono tutta la superficie disponibile, l'artista utilizzò una tavolozza di colori ricca di riflessi e sfumature simili a quelli della seta.  Alle pareti il racconto delle storie di Mosè: la nascita miracolosa di una sorgente dalle rocce, la caduta della manna dal cielo, il passaggio del Mar Rosso e l'adorazione del serpente di bronzo.

La volta, suddivisa in quattro parti e decorata con immagini di Santi, aveva inizialmente al centro lo stemma Medici-Toledo, poi sostituito dall'antica rappresentazione della Trinità con il volto di Cristo trifronte.
Ma il punto focale della cappella è la pala d'altare con la "Deposizione di Cristo", che Cosimo donò al cancelliere dell'Imperatore Carlo V, commissionando poi al Bronzino una seconda versione, quella che noi oggi ammiriamo.

Al centro della composizione il corpo di Cristo deposto dalla croce è delicatamente sostenuto dalla madre e dall'apostolo Giovanni, mentre, Maria Maddalena affranta e in adorazione ne abbraccia i piedi. In secondo piano a sinistra le pie donne piangenti, e a destra le figure di Giuseppe d'Arimatea e Nicodemo. In alto un gruppo di angeli mostra i simboli della Passione. Ai lati, affiancano il dipinto i due pannelli di una bellissima "Annunciazione".

Gli affreschi della cappella, superbo capolavoro del Bronzino, in un'armonia di forme e di colori, e in un intreccio di equilibrate figure ed eleganti espressioni, documentano la rapida evoluzione stilistica dell'artista e sono considerati tra i più raffinati del Manierismo fiorentino.